D-蟲熒光素遊離酸（D-Luciferin Free Acid）是螢火蟲螢光素酶（Firefly Luciferase）的天然發光底物，廣泛用於生物化學分析與小動物活體造影（In vivo imaging）。

一、 基本化學性質

• CAS 號碼：2591-17-5

• 分子式與分子量：C11H8N2O3S2=280.32

• 外觀：類白色至淡黃色粉末

• 純度與水效：純度 ≥99.0%(HPLC))，水分（KF）≤2.0%

• 化學結構：(S)-2-(6-Hydroxy-2-benzothiazolyl)-2-thiazoline-4-carboxylic acid

• 溶解特性：與鈉鹽或鉀鹽不同，遊離酸形態微溶或不溶於純水及中性緩衝液（PBS）。可溶於 DMSO（最高可達約 50 mg/mL）或甲醇。

二、 生物醫學用途

• 小動物活體造影（In vivo Bioluminescence Imaging, BLI）：搭配表現 Luciferase 基因的基因轉殖小鼠或細胞株，可即時、非侵入性地追蹤腫瘤生長、癌細胞轉移、幹細胞歸巢（Homing）及病原體感染路徑。

• 體外報告基因檢測（In vitro Reporter Gene Assay）：用於評估啟動子（Promoter）活性、基因表現量、信號傳遞路徑以及藥物高通量篩選（HTS）。

• 細胞毒性與 ATP 濃度測定：發光反應強度與 ATP 濃度成正比，可用於定量檢測細胞存活率、細胞增殖及凋亡情況。

三、 使用情境限制與配製注意事項

• 水溶性極差，需特定溶解步驟：

  • DMSO 配製：先將遊離酸溶解於 DMSO（如 50 mg/mL），再以 PBS 稀釋至工作濃度（須注意 DMSO 在細胞或動物體內的耐受毒性濃度上限）。

  • 鹼助溶法：若要配製純水溶液，需加入稀鹼（如 0.1M–1M NaOH 或 KOH將 pH 調高幫助溶解，完全溶解後再用稀酸（如 HCl將 pH 值調回約 7.4 中性環境。

• 活體實驗通常優先選擇鹽類：因遊離酸溶解操作較繁瑣，進行動物注射（如腹腔注射 IP）時，多數實驗者會優先選用高水溶性的 D-蟲熒光素鈉鹽（D-Luciferin Na） 或 鉀鹽（D-Luciferin K）。

• 生物發光反應依賴因子：發光反應必須在 Mg 2+、ATP 及分子氧O2 同時存在下才能正常催化發光（波長約 560 nm）。若環境缺氧或 ATP 耗竭，發光訊號會大幅下降。

四、 保存與保存期限

• 避光保存：D-蟲熒光素對光敏感，無論是粉末或溶液皆需嚴格光照防護（使用棕色瓶或鋁箔紙包覆）。

• 儲存溫度：乾粉建議存於 -20 C 或 $-80 C 乾燥環境。

• 分裝避免凍融：配製好的溶液應小量分裝（Aliquot）於 $80 C 冷凍保存，避免反覆凍融導致底物降解失效。