|
|
|
|
|
| |
|
|
| Prestain Protein Marker (1.2-45kDa) |
產品名稱 ： Prestain Protein Marker (1.2-45kDa)
產品編號 ： Bio-PPK-1245
產品規格 ： 10T
廠 牌 ： Biokit |
| 詳細資料 |
產品編號及規格：MK1245 10T（50μl）
儲存條件： -20℃保存，開封後有效期 12 個月
產品簡介：
彩虹預染超低分子量蛋白質 Marker 可以直接觀察蛋白電泳及清晰判斷 Western Blotting 的轉膜效果。本產品包含 3 種多肽和 3 種低分子量蛋白質組成，分子量範圍為 1.2kD-45kD，分子量大小為
1.2kD， 4.6kD，10kD，16kD，27kD，45kD (注：蛋白大小已在 18%Tricine-SDS-PAGE 中用非預染蛋白 Marker標定過)。
使用說明：
- 超低分子量多肽的蛋白電泳較常規的蛋白電泳更為複雜，請仔細參閱說明書後再進行操作。
- 第一次收到產品後，室溫徹底融化混勻，離心快甩將溶液完全收集到管底，根據需要適量分裝成小管，-20℃貯存，每次使用時取一小管使用。
一、制膠
a、配置分離膠
1、按照表一將不同體積的雙蒸水、40%PAA（19:1）、4x 凝膠緩衝液和乙二醇加入到小燒杯中混合。
2、加入 10%APS 和 TEMED，立即混勻 5-10 秒，以使溶液充分混勻。
3、在凝膠模具中迅速灌入適量分離膠溶液，然後在分離膠溶液上輕輕覆蓋一層 1-3cm 的水層，使凝膠表面保持平整。
4、靜置 30-60 分鐘，待分離膠和水層之間出現一個清晰的介面表示凝膠已經聚合。
b、配置濃縮膠（去除覆蓋在分離膠上的水層，用濾紙將殘留的水吸去）
1、按照表一將不同體積的雙蒸水、40%PAA（29:1）和凝膠緩衝液加入到小燒杯中混合。
2、加入 10%APS 和 TEMED，立即混勻 5-10 秒，以使溶液充分混勻。
3、將梳子插入凝膠內，避免產生氣泡。
4、靜置 30-60 分鐘裝待凝膠聚合。
表一（一塊厚度 0.75mm 凝膠用量)
| |
分離膠 |
濃縮膠 |
| |
18%T，5%C/6.0ml |
5%T,3.3%C/4.0ml |
| 40%PAA(19:1) |
2.7ml |
/ |
| 40%PAA(29:1) |
/ |
0.5ml |
| 4X 凝膠緩衝液 |
1.5ml |
1ml |
| 乙二醇（電泳級） |
1.8ml |
/ |
| ddH2O |
/ |
2.5ml |
| 10%APS |
45ul |
30ul |
| TEMED |
9ul |
6ul |
二、電泳：
1、 取一管分裝好的 Marker 樣品，95℃處理 5 分鐘，充分混勻後備用。
2、電泳前，將 10X 陽極緩衝液和 10X 陰極緩衝液用蒸餾水稀釋成 1X 緩衝液備用。將電泳槽的外槽加入 1X 陽極緩衝液，內槽加入 1X 陰極緩衝液，輕柔拔出梳子，將 Marker 或蛋白樣品（已經過 2X Tricine 上樣緩衝液處理）加入點樣孔，80-120V 電泳 30-60 分鐘左右，待指示前沿到達分離膠上沿時，把電壓調到 150-200V，至藍色指示前沿至分離膠 3/4 位置時即可停止電泳。整個電泳過程大概需
要 2-3 個小時。注：如果電泳時間過短，在染色時指示前沿容易遮擋小於 5kd 的小肽。
三、染色
根據常規實驗步驟，用配方 7 和 8（表二）進行染色和觀察。如果使用配方 7 進行染色時效果不好或者考慮其毒性，可以選擇考馬斯亮藍蛋白膠快速染色液，該產品除具有染色快、無毒、靈敏性高等特點外，還能對小肽在染色中起到固定作用，不至於小肽在染色和脫色中從凝膠中脫離，是常規染色液的理想替代品。
注：預染蛋白 Marker 由於嵌合了染料，在不同的凝膠系統中遷移率會有不同，因此只能用來粗略估計目的蛋白的大小。如要精確確定蛋白大小，請在同一凝膠系統中用非預染蛋白 Marker 來標定預染蛋白 Marker 的分子量。
表二 小分子蛋白質 SDS-PAGE 電泳試劑配製
1、40%PAA（29:1）（配製濃縮膠）
丙烯醯胺 38.67g
甲叉雙丙烯醯胺 1.33g
用 ddH2O 溶解後定容至 100ml，過濾後使用。貯存：4℃ |
2、40%PAA（19:1）（配製分離膠）
丙烯醯胺 38g
甲叉雙丙烯醯胺 2g
用 ddH2O 溶解後定容至 100ml，過濾後使用。貯存：4℃ |
3、4X 凝膠緩衝液（配置凝膠用）
（3M Tris; 0.3% SDS; pH8.45)
Tris 堿 182g 、 ddH2O 300ml
1.5g SDS 或 15ml 10% SDS、用 HCL 調 pH 值至 8.45
用 ddH2O 定容至 500ml 貯存：4℃ |
4、10X 陽極緩衝液（下槽緩衝液）（2M Tris pH8.9)
Tris 堿 121.1g 、 ddH2O 400ml
用 HCL 調 pH 值至 8.9、用 ddH2O 定容至 500ml
貯存：4℃
注：使用前稀釋成 1X 陽極緩衝液使用 |
5、10X 陰極緩衝液（上槽緩衝液）
（1M Tris：1M Tricine; 1% SDS; pH8.3)
Tris 堿 121.14g、 Tricine 179.2g、 SDS 10g
用 ddH2O 溶解定容至 1000ml（不用調pH 值）貯存：4℃
注：使用前稀釋成 1X 陽極緩衝液使用 |
6、2X Tricine 蛋白樣品上樣緩衝液（10ml）
1ml 1M Tris-HCL pH 6.8 、2.4ml 甘油、0.8g SDS
0.31g DTT（或者 400ul β-巰基乙醇)
2mg 考馬斯亮藍 G-250
用滅菌 ddH2O 定容至 10ml
混勻分裝-20℃貯存備用 |
7、染色液
冰醋酸 100ml 、 考馬斯亮藍 G-250 0.25g
水 900ml |
8、脫色液
冰醋酸 100ml
水 900ml |
Storage Condition: -200C
|
|
 購物說明： |
|
|
|
|
|
|
